发布日期：2020-07-23 19:23
腺病毒包装的操作流程以及相关的技术问题
腺病毒包装
重组腺病毒是一种复制缺陷型腺病毒载体系统，广泛用于基因治疗，基础生命科学研究等领域。 重组腺病毒具有以下显着优势：感染范围广，几乎所有细胞系，原代细胞和某些组织均可被感染； 感染效率高达100％，可以完全超过其他病毒载体工具和脂质体转染。 大源基因携带能力（高达8Kb）； 非整合基因组 高滴度，操作方便。 因此，重组腺病毒是最有前途的基因传递工具之一。
当前常用的腺病毒载体基于5型人腺病毒（Ad5），其基因组为36Kb长的线性双链DNA。 腺病毒可以通过自身的纤维（纤维）与细胞表面的受体结合，被内吞到细胞中，然后利用细胞的转录和翻译机制从内体（内体）转移到细胞质和细胞核，从而开始复制和复制。而腺病毒包装下，完整的病毒生命周期将导致细胞死亡并释放病毒颗粒。
目前，最常用的腺病毒包装系统是AdEasy和AdMAX。 共同特征是首先将靶基因克隆到穿梭载体中，然后重组到大腺病毒主链中。 这两个系统在腺病毒的早期转录复制基因E1和E3中都有缺陷，并且E3基因对于病毒生产不是必需的。 因此，腺病毒包装必须依靠表达E1的细胞系，例如HEK-293，HEK-293A等。
与Adeasy系统相比，AdMAX系统易于操作并且可以获得更好的病毒滴度。 这些说明基于AdMAX系统，该系统由pHBAd系列穿梭质粒和腺病毒主链载体pBHGloxδE1、3Cre双载体组成。
Baffir Biology的腺病毒是5型血清型腺病毒，它已经删除了腺病毒早期表达基因序列的E1和E3区。 E1是腺病毒复制所必需的，缺少E1使其无法自行复制。 它只能依靠包装细胞（例如HEK293细胞）提供的反式互补进行复制和扩增，以确保腺病毒的安全性。 E3基因表达的蛋白质可以对抗宿主的抗病毒防御系统，而E3区域的去除可以降低宿主体内的免疫系统。流行病应对。
Baffir的腺病毒包装使用最新的AdMax系统，通过Cre-loxp重组酶，将腺病毒载体穿梭质粒和骨架质粒（腺病毒基因组）共转染到HEK293细胞质粒中）在重组酶的作用下产生重组腺病毒， 所得病毒滴度较高，病毒滴度可达1×10 ^ 12pfu / ml。 布法罗生物系统的腺病毒载体有CMV，mCMV，CAG，PGK，UbC，EF1a和许多其他启动子可供选择； 并且有许多荧光标记蛋白，例如EGFP，ZsGreen，tdTomato，mCherry，EYFP等。
原理是同源重组。 将目标基因表达盒插入腺病毒的左臂区域（通常缺少E1基因区域）以形成腺病毒穿梭质粒，然后用腺病毒基因组（通常缺失）将携带E1基因区域的细胞与大质粒一起转染 例如，在293细胞中，这两个质粒通过在293细胞中的同源重组形成重组腺病毒基因组，并包装成病毒颗粒。 主要缺点是重组效率较低。
与目前最流行的AdEasy系统相比，具有一定的优势：AdMax系统仅需2-4周即可完成从质粒构建到病毒重组的整个过程，成功率大于98％ （其中95％的克隆包含靶基因），因为该病毒在真核细胞中重组，因此它维持了腺病毒生存的压力，从而有助于重组腺病毒基因组的完整性。 AdEasy系统的成功率只有18-34％（Stratagene的新版本AdEasy XL系统的成功率约为94％），病毒基因组在原核细胞中重组（BJ5183）。 从理论上讲，失去生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，病毒的遗传背景和活性可能会受到影响。
腺病毒包装的主要困难是如何在腺病毒主链载体上构建外源基因表达盒或外源shRNA表达盒。 由于腺病毒主链载体相对较大（> 30kb），并且在载体中几乎有多个共同的限制性酶切位点，因此，如果通过常规限制性连接方法将外源基因或shRNA表达盒构建到腺病毒中， 成功率很低。 因此，目前的腺病毒表达系统基本上使用同源重组将外源基因或shRNA表达盒构建到腺病毒骨架载体上。
HonorGene的病毒打包平台技术团队在腺病毒打包方面拥有丰富的经验。 自腺病毒包装技术服务发展以来，已成功包装了数百种各种类型的腺病毒，成功率高达99％； 包装的最大靶基因超过4k； 腺病毒滴度不低于109pfu / ml，订购1ml基本可以满足您的实验需求。
